Biological Test Results

El objetivo de esta investigación fue estudiar en ratones el efecto del agua activada MRET como agente potencial para la prevención y tratamiento de dos tipos de enfermedades oncológicas (modelos de laboratorio del tumor ascítico de Ehrlich y la forma ascítica del Sarcoma). Se observó un efecto positivo significativo del agua activada MRET respecto a la resistencia tumoral en animales en los experimentos realizados en 500 ratones (22 grupos con 20 ratones en cada grupo y 10 grupos con 5 ratones en cada grupo). Los mejores resultados se observaron en los grupos de ratones con agua MRET activada durante 30 minutos (régimen óptimo de activación). La eficacia antitumoral sustancial fue confirmada por un nivel muy alto de reducción del Número Total de Células Tumorales Viables del 76% en el régimen de «tratamiento preventivo» y del 55% en el régimen de «tratamiento terapéutico». La esperanza de vida de los ratones que recibieron agua activada óptima aumentó un 61% en el régimen de «tratamiento preventivo» y un 43% en el régimen de «tratamiento terapéutico». El efecto antitumoral significativo del Agua Activada MRET en ratones fue cercano a la acción de los agentes de quimioterapia y permitió evitar los efectos secundarios que típicamente siguen al tratamiento de quimioterapia en oncología.

Se presentan los resultados de la investigación de la aplicación del agua activada por el proceso no ionizante de Tecnología de Efecto de Resonancia Molecular (MRET) para el tratamiento preventivo y mejora de la resistencia tumoral de animales a dos tipos de enfermedades oncológicas in vivo en 500 ratones. La investigación realizada en parámetros físicos del agua confirmó que el proceso de activación MRET contribuyó a la modificación sustancial de las propiedades físico-moleculares básicas del agua destilada (reducción sustancial de la viscosidad como función de la presión tangencial aplicada, así como la disminución sustancial de la conductividad eléctrica y la permitividad dieléctrica como funciones de las frecuencias del campo electromagnético aplicado). Se observó el efecto positivo significativo del agua activada MRET en la resistencia tumoral de animales en el proceso de esta investigación en todos los grupos de ratones con diferentes fracciones de agua activada. Los mejores resultados se observaron en los grupos de ratones con agua MRET activada durante 30 minutos (régimen óptimo de activación). Los resultados fueron mejores en el régimen de «tratamiento preventivo» comparado con el régimen de «tratamiento terapéutico». Adicionalmente, esta investigación confirmó que la preservación a largo plazo del agua activada a baja temperatura (alrededor de 0°C) durante 45 días disminuyó su eficacia antitumoral pero la dejó en un nivel significativamente alto comparado con otras fracciones. Los resultados de las pruebas apuntan al mecanismo dual del efecto del agua MRET en tumores: la prevención e inhibición del crecimiento tumoral junto con la reducción de la cantidad de células tumorales viables. El efecto antitumoral significativo del agua destilada activada MRET en ratones fue cercano a la acción de los agentes de quimioterapia y permitió evitar los efectos secundarios que típicamente siguen al tratamiento de quimioterapia de la oncología.

En el proceso de investigación de la actividad citotóxica de las células NK se observó un aumento significativo de los niveles de citotoxicidad de linfocitos cuando los ratones donantes fueron tratados con agua MRET activada durante 30 minutos. Los resultados también mostraron que la extensión de la aplicación del agua MRET de 14 días a 21 días aumentó significativamente el valor del índice de citotoxicidad. Es posible admitir que la extensión del tiempo de aplicación del agua MRET llevará a niveles más altos de mejora en la actividad de las células NK. Así, la aplicación del agua activada MRET puede ser un enfoque bastante prometedor para la estimulación no farmacológica de las vacunas de inmunización de células NK.

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Las investigaciones in vitro en células normales PMBC (células mononucleares de sangre periférica) y en células cancerosas HeLa (línea celular ATCC # CCL-2 adenocarcinoma cervical) fueron realizadas bajo la supervisión de Patrick Pezzoli, Ph.D. en AltheaDx Technologies, San Diego, EE. UU. Los experimentos analizaron: células lisadas a las 0 horas, células cultivadas durante 24 horas en medio no tratado y células cultivadas durante 24 horas en medio tratado con activador MRET durante 30 minutos. Las muestras de ADN de cada lote fueron procesadas y los datos resultantes fueron analizados usando Affymetrix Genotyping Console 3.0 para obtener llamadas de genotipo y llamadas de número de copia. Los conteos de células y % de viabilidad fueron obtenidos usando la técnica de exclusión de Azul de Tripano.

Los datos experimentales revelaron ninguna diferencia entre la hora cero (control), las muestras tratadas con MRET y no tratadas en términos de genotipos y llamadas de número de copia. Así, la activación MRET del medio basado en agua no indujo ningún cambio en las células a nivel genético.

Los estudios mostraron que en el medio activado MRET la viabilidad de las células normales (PBMC) fue mayor (Tabla 1), y la viabilidad de las células cancerosas (HeLa) fue menor (Tabla 2) comparada con su viabilidad en medio no tratado.

Para las células normales (PBMC) los cambios en los conteos de células fueron similares para el medio no tratado y tratado con MRET (Fig 1). Así, el tratamiento MRET no afectó el crecimiento de las células normales.

Para las células cancerosas (HeLa) los datos experimentales revelaron inhibición significativa del crecimiento de células cancerosas en medio tratado con MRET. El crecimiento de células cancerosas viables fue inhibido un 54% en medio tratado con MRET comparado con medio no tratado (Fig 2).

Fig 1: Conteos de células PBMC viables después de 24 horas de incubación Fig 2: Conteos de células HeLa viables después de 24 horas de incubación
Los resultados de la investigación de AltheaDx en células cancerosas HeLa in vitro apoyan los resultados obtenidos anteriormente en la investigación respecto a los efectos del agua MRET en la resistencia tumoral en modelo animal. El estudio en 500 ratones fue realizado bajo la supervisión del Profesor V. Vysotskii, S. Olishevsky, Ph.D. y Y. Yanish, Ph.D. en el Instituto de Patología Experimental, Oncología y Radiobiología de Kyiv de la Academia de Ciencias de Ucrania. Mostró inhibición sustancial del crecimiento de células tumorales viables después del consumo de agua MRET. En el curso de esta investigación los grupos de ratones en «régimen preventivo» ingirieron agua MRET durante 2 semanas antes de la inoculación de células cancerosas del carcinoma de Ehrlich y durante 3 semanas después de la inoculación. Los grupos de ratones en «régimen terapéutico» ingirieron agua MRET solo durante 3 semanas después de la inoculación de células cancerosas del carcinoma de Ehrlich. Después del consumo de agua MRET activada durante 30 minutos (el tiempo óptimo de activación) el crecimiento de células tumorales viables fue inhibido un 76% en «régimen preventivo» y un 55% en «régimen terapéutico.»

Como conclusión es posible decir que los estudios realizados en AltheaDx Technology confirmaron que el agua activada MRET no afectó las células a nivel genético; afectó la morfología de las células normales de manera positiva aumentando su viabilidad y promovió inhibición significativa del crecimiento de células cancerosas.

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Se realizó una observación clínica en un paciente sometido a tratamiento de quimioterapia para cáncer nasofaríngeo metastásico. Regularmente, los conteos de GBB usualmente disminuyen a un nivel muy bajo. El rebote de GBB desde este rango bajo toma aproximadamente 3-5 semanas. La ingestión de agua MRET previno la disminución de los conteos de GBB a su nivel más bajo y ayudó a recuperar el nivel pre-quimioterapia dentro de un período de tiempo inusualmente corto de 3 días.

Así, la observación clínica reveló que en el día 10 después del comienzo de la quimioterapia (en 3 días después de que los conteos de GBB cayeron al 10% del nivel pre-quimioterapia) los conteos de GBB rebotaron al 93% de su nivel pre-quimioterapia. En cumplimiento con los criterios de Distribución de Student el rebote de GBB fue más alto que el 70% del nivel pre-quimioterapia con p=0.05.

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Las pruebas realizadas en C.A.I. Environmental Laboratory, Carlsbad, EE. UU. revelaron la reducción significativa de la cantidad de coliformes totales después del proceso de activación MRET. En el agua de lluvia activada durante 30 minutos la cantidad de coliformes totales disminuyó un 86% después del proceso de activación del agua. Esta prueba confirma que el agua MRET actúa como agente antibacteriano, proporcionando efecto de esterilización.

La investigación fue realizada en el Instituto de Microbiología y Virología de Kyiv de la Academia de Ciencias de Ucrania.

La investigación reveló el efecto significativo del medio nutritivo activado MRET en ambiente aeróbico en el proceso de crecimiento y reproducción de microorganismos E.coli, su división, el tamaño de las colonias y la modificación de formas de células de cultivo. Se observó que a baja concentración inicial de células del cultivo investigado Escherichia coli K-12 el medio nutritivo MRET activado durante 30 minutos y 60 minutos inhibió el crecimiento del cultivo 27 y 303 veces respectivamente durante las 25 horas del experimento.

La vista inicial de placas de Petri con diferentes fracciones de medio nutritivo al comienzo del experimento se presenta en la Fig 1.

Fig 1: Placas de Petri al comienzo del experimento. Se introdujo una cantidad idéntica muy pequeña de células de Escherichia coli K-12 en la superficie del medio nutritivo no activado de placas de control y en la superficie de placas con medio nutritivo activado MRET durante 30 y 60 minutos (tact=0.5h y tact=1.0h) en ambiente aeróbico. No hay colonias de microorganismos en las placas de Petri al comienzo del experimento.

Las placas de Petri con colonias crecidas y parámetros estadísticos de las colonias después de 23 horas de experimentos se presentan en la Fig 2: (a) medio nutritivo no activado (control); (b) medio nutritivo activado durante 30 minutos; (c) medio nutritivo activado durante 60 minutos. Las placas de Petri después de 29 horas de experimento se muestran en la Fig 3. Se reveló la inhibición significativa del crecimiento de E.coli en las muestras activadas y confirmó el fuerte efecto bacteriostático del medio activado MRET.

Este experimento muestra que el proceso de activación MRET tiene un efecto bacteriostático muy fuerte en microorganismos E.coli condicionalmente patógenos y que la inhibición del crecimiento de E.coli es más efectiva cuando se aumenta el tiempo de activación. Se observó que a baja concentración inicial de células de E.coli en medio nutritivo la activación MRET durante 30 minutos y 60 minutos de tiempo inhibió el crecimiento del cultivo N_C/N_0.5 = 27 y N_C/N_1.0 = 303 veces respectivamente después de 25 horas de experimento (Fig 4). Consecuentemente, el nivel de actividad bacteriostática fue del 96% en medio nutritivo activado durante 30 minutos y del 99,7% en medio activado durante 60 minutos. Así, se confirmó la correlación directa entre la actividad bacteriostática del medio nutritivo activado MRET y el tiempo de activación.

Fig 4: La inhibición del crecimiento de E.coli en ambiente aeróbico: 303 veces (t_act=1.0 hora) y 27 veces (t_act=0.5 hora) después de 25 horas de experimento (color azul — control, rojo — 30 minutos y verde — 60 minutos medio activado MRET).

Este experimento también reveló el fuerte efecto del agua activada MRET en el proceso de división de microorganismos E.coli, la modificación de formas de células de cultivo y el tamaño de las colonias. Se observó que una de las razones del crecimiento anormalmente bajo de bacterias E.coli estaba relacionada con la modificación del proceso de división celular en medio nutritivo activado MRET. En el proceso de crecimiento y reproducción un gran número de células no se separaron entre sí y se formaron alineaciones lineales que consistían en 2-3 células emparejadas secuencialmente. Las células de cultivo crecidas en medio no activado y activado MRET se muestran en la Fig 5 y Fig 6 respectivamente.

II. El efecto del agua MRET en la actividad metabólica de bacterias E.coli en ambiente aeróbico y anaeróbico

La actividad reductora es una característica integral de la actividad metabólica de microorganismos y se mide con la ayuda del indicador de color Resazurina de Sodio en el grado porcentual de decoloración (púrpura = 0%, rojo = 50%, transparente = 100%). La actividad reductora de bacterias E.coli se redujo hasta 3 veces en agua activada MRET durante 30 minutos y hasta 1.6 veces en agua activada durante 60 minutos durante las primeras 6 horas de experimento en ambiente aeróbico (Fig 7 y 8).

Fig 7: Prueba comparativa en actividad metabólica (reductora) de E.coli (muestras de control, agua activada MRET durante 30 y 60 minutos) en ambiente aeróbico: R — actividad reductora (en Control, 0.5 hora y 1.0 hora agua activada MRET), K — actividad reductora relativa, D — densidad óptica.

Fig 8: Actividad Reductora Relativa de E.coli en agua MRET activada durante 0.5 hora (K_0.5=R_0.5/R_C — color rojo) y durante 1.0 hora (K_1.0=R_1.0/R_C — color verde) comparado con muestras de control no activadas (K_C=1 — color azul) en ambiente aeróbico.

Este experimento mostró que no había correlación directa entre la inhibición de la actividad metabólica (reductora) y la inhibición del crecimiento de E.coli (actividad bacteriostática) en agua activada MRET. El efecto bacteriostático es sustancialmente más alto en agua activada durante 60 minutos y la inhibición de la actividad reductora durante las primeras 3 horas es más alta en agua activada durante 30 minutos. Así, este experimento reveló que el tiempo óptimo de activación para la máxima inhibición de la actividad metabólica de bacterias E.coli en ambiente aeróbico es 30 minutos. El mismo tiempo óptimo de activación fue encontrado en el proceso de otra investigación respecto a la aplicación del agua activada MRET para tratamiento preventivo y mejora de la resistencia tumoral in vivo en 500 ratones para dos tipos de cáncer realizada en el Instituto de Patología Experimental, Oncología y Radiobiología de Kyiv de la Academia de Ciencias de Ucrania.

Tomando en consideración que una pequeña población de bacterias patógenas, como E.coli, usualmente está presente en asociaciones microbianas complejas en el intestino del cuerpo, se realizó la prueba en actividad metabólica de bacterias E.coli en ambiente anaeróbico. El ambiente anaeróbico simula las condiciones ambientales similares a las condiciones en el intestino de humanos y animales. La investigación mostró que la actividad reductora de bacterias E.coli en ambiente anaeróbico prácticamente no cambió (Fig 9 y 10).

Fig 9: Prueba comparativa en actividad metabólica (reductora) de E.coli (muestras de control, 0.5 hora y 1.0 hora agua activada MRET, K_STER — referencia a esterilidad) en ambiente anaeróbico: R — actividad reductora (en Control, 0.5 hora y 1.0 hora agua activada MRET), K — actividad reductora relativa, D — densidad óptica, V — volumen de gas en las botellas.

Fig 10: Actividad Reductora de E.coli en agua activada MRET durante 30 y 60 minutos y en muestras de Control no activadas (R_0.5 — color rojo, R_1.0 — color verde, R_C — color azul) en ambiente anaeróbico.

Este experimento reveló que el proceso de activación MRET no tuvo ningún efecto significativo en la actividad reductora de bacterias E.coli en ambiente anaeróbico.

Con el fin de simular las condiciones ambientales similares a las condiciones en el intestino de humanos y animales se realizó la prueba en actividad metabólica de asociaciones microbianas en ambiente anaeróbico. Se encontró que el agua activada MRET aumentó sustancialmente la actividad reductora de asociaciones microbianas complejas durante las primeras varias horas del experimento (Fig 11).

Fig 11: Prueba comparativa en actividad metabólica (reductora) de asociaciones microbianas (1.0 hora y 0.5 hora agua activada MRET y muestras de Control) en ambiente anaeróbico: R — actividad reductora (en Control, 0.5 hora y 1.0 hora agua activada MRET), K — actividad reductora relativa, V — volumen de gas en las botellas.

Este experimento reveló que el tiempo óptimo de activación para el máximo aumento de la actividad metabólica de asociaciones microbianas en ambiente anaeróbico fue 30 minutos. El mismo tiempo óptimo de activación fue encontrado en el proceso de inhibición de la actividad metabólica de E.coli en ambiente aeróbico y en otra investigación respecto a la aplicación del agua activada MRET para tratamiento preventivo y mejora de la resistencia tumoral in vivo.

Esta investigación reveló que a baja concentración inicial de células del cultivo microbiológico condicionalmente patógeno Escherichia coli K-12 en medio nutritivo basado en agua activado durante 30 minutos y 60 minutos el crecimiento del cultivo fue inhibido 27 y 303 veces respectivamente después de las 25 horas del experimento en ambiente aeróbico. Este experimento también reveló el fuerte efecto del agua activada MRET en el proceso de división de microorganismos E.coli, la modificación de formas de células de cultivo y el tamaño de las colonias. Se observó que una de las razones del crecimiento anormalmente bajo de la población de E.coli estaba relacionada con la modificación del proceso de división celular en medio nutritivo activado MRET. Estos resultados permiten admitir que el proceso de activación MRET y el efecto de esterilización del agua MRET pueden ser aplicados en la industria alimentaria y para la purificación del agua.

La segunda etapa de la investigación reveló que la actividad metabólica (reductora) de bacterias E.coli se redujo hasta 3 veces en agua activada durante 30 minutos y hasta 1.6 veces en agua activada durante 60 minutos durante las primeras 6 horas del experimento en ambiente aeróbico. Otro experimento mostró que el proceso de activación MRET no afectó la actividad reductora de bacterias E.coli en ambiente anaeróbico y, consecuentemente, no debería afectar una pequeña población de bacterias condicionalmente patógenas, como E.coli, usualmente presente en asociaciones microbianas en el intestino del cuerpo.

Con el fin de simular las condiciones ambientales similares a las condiciones en el intestino de humanos y animales se realizó la prueba en actividad metabólica de asociaciones microbianas complejas en ambiente anaeróbico. Se descubrió que el proceso activado MRET aumentó sustancialmente la actividad reductora de asociaciones microbianas complejas durante las primeras horas del experimento. El mismo tiempo óptimo de activación de 30 minutos fue observado en el proceso de inhibición de la actividad metabólica de bacterias E.coli condicionalmente patógenas en ambiente aeróbico y para el máximo aumento de la actividad metabólica de asociaciones microbianas complejas en ambiente anaeróbico (presente en el intestino). La investigación anterior respecto a la aplicación del agua activada MRET para tratamiento preventivo y mejora de la resistencia tumoral en oncología in vivo en 500 ratones también mostró los mejores resultados en agua activada MRET durante 30 minutos. Así, esta investigación muestra que la ingestión de agua MRET es beneficiosa para el proceso de digestión y puede mejorar el metabolismo del cuerpo.

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La investigación fue realizada en la Universidad Nacional Shevchenko de Kyiv, Ucrania en 400 ratones. Se utilizaron ratones machos de la línea BALB de edad de 11 — 13 semanas y de peso 18 — 21 gramos. En el proceso de investigación todos los ratones fueron divididos en tres grupos. Antes de la inoculación del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 un grupo de ratones consumió agua MRET durante 4 semanas (Grupo 1), otro grupo consumió agua MRET durante 2 semanas (Grupo 2), el grupo control consumió agua destilada ordinaria no activada. Durante las siguientes 2 semanas del experimento los dos primeros grupos continuaron consumiendo agua MRET y el grupo control consumió agua destilada ordinaria. La primera línea de experimentos fue realizada en 225 ratones con el fin de analizar la persistencia del patógeno en homogeneizado de riñones de ratones comparando 5 grupos de ratones (dos Grupo 1 y dos Grupo 2 en agua activada MRET durante 15 minutos y 30 minutos y Control). Después de experimentos preliminares se eligió el agua activada MRET óptima de 30 minutos (destilada) para la línea principal de investigación.

Las propiedades protectoras significativas del agua MRET fueron confirmadas por la disminución sustancial de UFC (unidades formadoras de colonias) de Staphylococcus en homogeneizado de riñones de ratones con agua MRET comparado con el grupo control de ratones después de la infección estafilocócica intra-peritoneal después de las primeras 24 horas. El análisis de datos al comienzo de los experimentos lleva a la conclusión de que la disminución significativa de colonias del patógeno en homogeneizado de riñones de ratones con agua MRET comienza solo después de 24 horas después de la inoculación del cultivo de Staphylococcus. Los resultados en agua activada durante 30 minutos fueron mucho mejores que en agua activada durante 15 minutos y todos los experimentos posteriores fueron realizados en agua activada durante 30 minutos.

No hubo ningún caso de muerte animal en todos los grupos investigados dentro de las primeras 24 horas después de la inoculación intra-peritoneal del cultivo de Staphylococcus, lo cual es un resultado bastante estándar. Durante los siguientes 8 días el 30% de los animales murió en el grupo control, lo cual también es un resultado estándar. Pero no hubo casos de muerte en ambos grupos de ratones que ingirieron agua activada MRET y es un resultado notable. Sin embargo, las principales consecuencias de la infección por Staphylococcus no se manifiestan en la muerte de animales como en el caso de enfermedades oncológicas. El virus Staphylococcus afecta los sistemas vivos y órganos del cuerpo. Estos microorganismos patógenos causan inflamaciones, supuraciones, abscesos, forúnculos, angina, condiciones sépticas, etc. Por eso se realizó una investigación detallada del proceso de estimulación por agua MRET de fagocitos y de órganos linfoides del sistema inmune de ratones infectados con cultivo de Staphylococcus aureus y se presenta en este reporte.

La inflamación local fue inducida con la ayuda de la inoculación del cultivo de Staphylococcus aureus en la pata trasera izquierda. La reacción inflamatoria ordinaria fue observada en el grupo de ratones con agua no activada: el enrojecimiento intenso de la pata trasera izquierda (Fig 1). Ambos grupos de ratones con agua MRET no desarrollaron ningún enrojecimiento en la pata trasera izquierda inoculada con cultivo de Staphylococcus aureus (Fig 2). Los resultados de este experimento confirman el hecho de la inhibición sustancial de la infección inflamatoria en caso del consumo regular de agua MRET.

4. El consumo de agua MRET estimula la actividad del sistema fagocítico y el nivel de resistencia natural de animales a microorganismos patógenos.

Para la siguiente serie de experimentos la inoculación de Staphylococcus aureus Wood-46 fue realizada intra-peritoneal en dosis LD30 con el fin de esparcir la infección por todo el cuerpo.

El sistema fagocítico es uno de los principales factores de resistencia natural no específica celular a infecciones e inflamaciones. Es la primera línea de protección de un organismo contra la penetración y reproducción de microorganismos patógenos. El papel protector de las células fagocíticas se basa en su capacidad de identificar, engullir y utilizar los agentes extraños penetrados en el ambiente interno de un macro-organismo. La fagocitosis es el mecanismo principal de resistencia natural especialmente en la primera etapa del proceso contagioso; es una parte regular de la formación de la respuesta inmune específica.

La metodología más común aplicada en los estudios de la actividad funcional de fagocitos es el examen de su actividad fagocítica (engullir células extrañas) y actividad bactericida dependiente de oxígeno. La actividad fagocítica de neutrófilos y macrófagos se estima basándose en el Índice de Fagocitosis (porcentaje de los fagocitos que engulleron bacterias de prueba) y en el Número Fagocítico (número promedio de bacterias de prueba engullidas por un fagocito). Los cultivos de Staphylococcus aureus y Latex son usualmente usados como bacterias de prueba. La actividad bactericida dependiente de oxígeno de fagocitos se estudia con la ayuda de la prueba NBT: una reducción dependiente de oxígeno de Nitro Blue Tetrazolium en un Diformazan insoluble derivado de Nitro Blue Tetrazolium por fagocitos. Con la ayuda de la prueba NBT es posible distinguir los fagocitos activados de los no activados.

El agua MRET estimuló las capacidades fagocíticas de neutrófilos de sangre periférica y macrófagos peritoneales aumentando su actividad fagocítica, particularmente los Índices Fagocíticos (Fig 3A) y el Número Fagocítico (Fig 3B). También estimuló su actividad bactericida dependiente de oxígeno, particularmente el aumento de la cantidad de fagocitos NBT-positivos (Fig 4).

Fig 3A: Índice Fagocítico de neutrófilos y macrófagos en dos semanas de experimento (objeto de fagocitosis - Staphylococcus aureus): 1 — Grupo Control; 2 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 4 semanas); 3 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 2 semanas).

Fig 3B: Número Fagocítico de neutrófilos y macrófagos en dos semanas de experimento (objeto de fagocitosis — Staphylococcus aureus): 1 — Grupo Control; 2 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 4 semanas); 3 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 2 semanas).

Fig 4: Actividad bactericida dependiente de oxígeno (prueba NBT) de neutrófilos y macrófagos en dos semanas de experimento:
1 — Grupo Control; 2 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 4 semanas); 3 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 2 semanas).

Estos experimentos confirmaron el aumento de los potenciales efectivos de fagocitos que constituyen uno de los principales factores de protección natural de un organismo e inician la respuesta inmune.

El análisis de datos al comienzo de los experimentos lleva a la conclusión de que la intensificación significativa de la actividad fagocítica y bactericida de macrófagos y neutrófilos de ratones con agua MRET comienza solo después de 24 horas después de la inoculación intra-peritoneal del cultivo de Staphylococcus. Al final de dos semanas de experimento los valores medios de los parámetros estudiados en ambos grupos de ratones con agua MRET aumentaron sustancialmente comparado con el grupo control. Las diferencias en los valores medios de los parámetros de la actividad funcional de fagocitos de grupos de ratones consumiendo agua MRET comparado con el grupo control de ratones con agua no activada fueron estadísticamente significativas con p<0.05 (para Índice Fagocítico y prueba NBT). Estos resultados confirman la intensificación significativa de la actividad fagocítica y bactericida y de la respuesta del sistema inmune después del consumo de agua MRET.

Las diferencias en los valores medios de los parámetros estudiados para los grupos de ratones con agua MRET comparados entre sí fueron estadísticamente insignificantes, lo cual confirma la similitud del nivel del efecto beneficioso del agua MRET en ambos grupos. Este hecho también confirma que el consumo regular de agua MRET proporciona beneficios de salud en un período de tiempo bastante corto (2 semanas en caso del modelo animal de ratones).

Al final de otra serie de experimentos en ambos grupos de ratones con agua MRET se observó un aumento sustancial estadísticamente significativo (p<0.05) del peso y la celularidad (cantidad de células) del bazo y ganglios linfáticos así como el aumento insignificante del peso y celularidad del timo (Fig 5 y Fig 6).

Fig 5: El peso de órganos linfoides en dos semanas de experimento: 1 — Grupo Control; 2 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 4 semanas); 3 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 2 semanas).

Fig 6: La celularidad de órganos linfoides en dos semanas de experimento: 1 — Grupo Control; 2 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 4 semanas); 3 — Ratones con agua MRET (preventivo durante 2 semanas).

Estos resultados confirman el hecho de la intensificación significativa de la respuesta del sistema inmune en animales con agua MRET sometidos a infección por Staphylococcus. La diferencia en los parámetros estudiados entre los grupos de ratones con agua MRET (4 semanas y 2 semanas de consumo preventivo de agua MRET) fue insignificante, lo cual confirma un efecto beneficioso bastante rápido del agua MRET en la actividad inmune de órganos linfoides.

Al comienzo del experimento la celularidad y el peso de órganos linfoides en grupos MRET no mostraron la tendencia distinta a modificaciones. Es razonable admitir que el consumo de agua MRET afecta el peso y la celularidad de órganos linfoides solo durante el período de infección.

El análisis de datos al comienzo del experimento lleva a la conclusión de que los cambios significativos en todos los parámetros estudiados de ratones con agua MRET (disminución de colonias del patógeno en homogeneizado de riñones, aumento del peso y la celularidad de órganos linfoides, intensificación de la actividad fagocítica y bactericida de macrófagos y neutrófilos) comienza solo después de 24 horas después de la inoculación del cultivo de Staphylococcus. En otras palabras, el consumo de agua MRET aumenta los potenciales de las capacidades inmunes del cuerpo para contrarrestar las infecciones sin ningún cambio en los parámetros vitales de órganos y funciones inmunes antes de la penetración de patógenos infecciosos en el cuerpo.

Al final de dos semanas de experimento los valores medios de los parámetros estudiados en ambos grupos de ratones con agua MRET (preventivo durante 4 y 2 semanas respectivamente) aumentaron significativamente comparado con el grupo control. Las diferencias en los valores medios de los parámetros estudiados de los grupos de ratones consumiendo agua MRET comparado con el grupo control de ratones con agua no activada fueron estadísticamente significativas con p<0.05 (para la mayoría de los parámetros). Estos resultados confirman la intensificación significativa de la actividad fagocítica y de la respuesta del sistema inmune después del consumo de agua MRET.

Las diferencias en los valores medios de los parámetros estudiados para los grupos de ratones con agua MRET comparados entre sí fueron estadísticamente insignificantes, lo cual confirma la similitud del nivel del efecto beneficioso del agua MRET en ambos grupos. Este hecho también confirma que el consumo regular de agua MRET proporciona beneficios de salud en un período de tiempo bastante corto (2 semanas en caso del modelo animal de ratones).

Los siguientes experimentos fueron diseñados para estudiar el efecto de la activación MRET en el proceso de crecimiento y desarrollo del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 in vitro en medio nutritivo (MPA — agar carne-peptona). El cultivo bacteriano fue crecido durante la noche hasta la fase estacionaria y luego fue sembrado en MPA en forma de suspensión a diferentes densidades de inoculación. El MPA con cultivo fue activado MRET durante diferentes períodos de tiempo (activación durante 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos y 60 minutos respectivamente) siguiendo los requisitos de esterilidad. Las placas de Petri con medio activado y no activado (MPA con cultivo) fueron cubiertas con tapas de vidrio (ambiente aeróbico) y colocadas en el termostato para cultivo a una temperatura de 37oC durante 18-24 horas.

Después del cultivo se observaron las propiedades morfológicas y tintoriales de los cultivos y se contaron los números de colonias crecidas en MPA. La actividad bacteriostática del medio nutritivo activado MRET (MPA) fue medida como un Índice de Actividad Bacteriostática (IBA). Un Índice de Actividad Bacteriostática se define como un coeficiente de la inhibición del crecimiento y reproducción de patógenos en medio bacteriostático, particularmente en medio nutritivo activado MRET. Se calcula como reducción del número de colonias (UFC — Unidades Formadoras de Colonias) en medio activado MRET relacionado con las muestras de control no expuestas a la activación:

IBA = (N_control — N_act)/N_control
donde N — número de colonias bacterianas (UFC) en Control (no activado) y medio nutritivo activado MRET, respectivamente.

Con el fin de verificar la esterilidad de los experimentos las placas de Petri con medio nutritivo (MPA) sin cultivo estafilocócico fueron expuestas al proceso de activación y luego fueron mantenidas en el termostato. No se observaron colonias de cultivo, lo cual confirma la esterilidad del ambiente.

Después de la investigación se observó la correlación directa entre los tiempos de activación (tact), las concentraciones iniciales del cultivo estafilocócico (N₀) y el número de colonias crecidas en medio activado MRET. Los resultados se presentan a continuación en forma de una serie de fotos de placas de Petri con las colonias crecidas en superficies de MPA y los siguientes diagramas basados en los datos de estos experimentos (Fig 7 — 12).

En el proceso de investigación se analizó el efecto de la activación MRET en el crecimiento del cultivo estafilocócico a concentración inicial bastante pequeña de patógenos. Los datos correspondientes a concentraciones iniciales más altas N0 > 10³ bacterias/ml no fueron analizados debido a las dificultades relacionadas con el cálculo de valores muy altos del número de colonias, a pesar del hecho de la alta actividad bacteriostática del medio nutritivo activado MRET en caso de concentraciones iniciales altas.

El efecto bacteriostático altamente significativo de 92 — 93% fue observado después de la activación MRET durante 30 minutos y más de cultivos con concentración inicial N₀ = 10³ bacterias/ml (Fig 7 y 8) y de 70 — 90% con concentración inicial de N₀ = 10² bacterias/ml (Fig 9 y 10). En caso de cultivos con baja concentración inicial N₀ = 10 bacterias/ml la actividad bacteriostática en medio nutritivo activado durante 15 minutos excedió 93% y en medio nutritivo activado durante 30 minutos se observó inhibición 100% de colonias estafilocócicas (Fig 11 y 12).

Fig 7: El efecto de la duración del tiempo de activación MRET en la inhibición del crecimiento del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 con concentración inicial del cultivo N₀ = 10³ bacterias/ml.

Fig 8: El efecto de la duración del tiempo de activación MRET en la inhibición del crecimiento del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 con concentración inicial del cultivo N₀ = 10³ bacterias/ml. IBA — Índice de Actividad Bacteriostática (reducción del número de colonias relacionado con las muestras de control no expuestas a activación).

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Fig 9: El efecto de la duración del tiempo de activación MRET en la inhibición del crecimiento del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 con concentración inicial del cultivo N₀ = 10² bacterias/ml.

Fig 10: El efecto de la duración del tiempo de activación MRET en la inhibición del crecimiento del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 con concentración inicial del cultivo N₀ = 102 bacterias/ml. IBA — Índice de Actividad Bacteriostática (reducción del número de colonias relacionado con las muestras de control no expuestas a activación).

Fig 11: El efecto de la duración del tiempo de activación MRET en la inhibición del crecimiento del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 con concentración inicial del cultivo N₀ = 10 bacterias/ml.

Fig 12: El efecto de la duración del tiempo de activación MRET en la inhibición del crecimiento del cultivo de Staphylococcus aureus Wood-46 con concentración inicial del cultivo N₀ = 10 bacterias/ml. IBA — Índice de Actividad Bacteriostática (reducción del número de colonias relacionado con las muestras de control no expuestas a activación).

1. La activación MRET del medio nutritivo basado en agua con cultivo estafilocócico suspendido lleva al origen de alta actividad bacteriostática del medio nutritivo que depende de la duración del tiempo de activación y concentración inicial de células del cultivo.

2. La actividad bacteriostática aumenta después del aumento del tiempo de activación (se estudiaron los tiempos de activación hasta 60 minutos).

3. La eficacia de la actividad bacteriostática aumenta después de la disminución de la concentración inicial de la suspensión del cultivo estafilocócico. El proceso de activación MRET es más efectivo en suspensiones de cultivo con la concentración no más de 10³ bacterias/ml.

4. Los resultados de la investigación proporcionan evidencia respecto a la alta eficacia de la activación MRET en la inhibición del crecimiento de colonias y reproducción de microorganismos estafilocócicos in vitro. Estos resultados permiten admitir que el proceso de activación MRET y el efecto de esterilización del agua MRET pueden ser aplicados en la industria alimentaria y para la purificación del agua.

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En este caso particular, la muestra de sangre del sujeto antes de la ingestión de Agua Activada muestra ataque de radicales libres en las células. Note las células sanguíneas «espinosas» que toman casi el 90% de la muestra. 30 minutos después, después de la ingestión de Agua Activada, la muestra de sangre muestra un ambiente sin radicales libres.

En este caso particular, la muestra de sangre del sujeto antes de la ingestión de Agua Activada muestra la llamada formación de Rouleau cuando las células sanguíneas están apiladas, formando un patrón similar a un gusano. 30 minutos después, después de la ingestión de Agua Activada, la mayoría de los patrones similares a gusanos se rompieron, formando patrones individuales de esferas redondas perfectas.

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Los exámenes de la influencia del agua activada MRET en plantas fueron realizados durante un período de 3 meses en el Instituto de Genética de Plantas de Kyiv de la Academia de Ciencias de Ucrania bajo la supervisión del Prof. V. Vysotskii, Universidad Nacional de Kyiv. El agua activada MRET aceleró el proceso de germinación de semillas de varias plantas (particularmente de repollo, calabaza, judía verde, rábano de jardín y guisantes) y mejoró su ciclo de crecimiento.